연구의

목적 및 내용

본 연구의 목표는 성 전환 어류인 해수 관상어 흰동가리를 실험재료로 사용하여, 성 분화와 성 전환에 영향을 미치는 호르몬적 인자의 결정 및 생식소의 발달과 생식소 분화의 메커니즘을 밝히고자 한다.

연구결과

1. 흰동가리의 생식주기 및 성 성숙 조사

: 생식주기에 따른 생식소의 발달 단계 및 성 전환 시기 파악

- 총 6단계인 미성숙 수컷, 성숙한 수컷, 암컷 제거 후 60일째 수컷, 암컷 제거 후 90일째

수컷, 암컷 제거 후 120일째 수컷 및 성숙한 암컷으로 구분하여 관찰한 결과, 90일째 GTH subunits 및 GTH receptor mRNA 발현량이 증가

- H-E 염색에 의한 생식소의 조직학적 관찰 결과, 90일째 난모세포의 수와 크기가 증가 하는 것이 관찰

- 혈장 E2 농도가 90일째 유의적으로 증가하는 것으로 보아 암컷 제거 후 90일째 수컷이 암 컷으로의 성 전환에 중요한 역할을 한다는 것을 제시

2. 성 결정 유전자의 분자적 특징 파악 및 성 전환 가능성 조사

: 성 전환시 특이적으로 발현되는 유전자의 클로닝 및 조직별 발현 조사

- ERb1 (esr2a1), ERb2 (esr2a2), vtg, TRα 및 TRβ cDNA의 클로닝 및 생식소 발달 단계 별 유전자의 발현 변화 확인

- 암컷을 제거한 후, 수컷이 암컷으로 성 전환 되는 시간대별로 특이적으로 발현되는 성 전환 관련 유전자의 발현을 확인

- Western blot 방법과 간세포 배양을 통하여 유전자 및 단백질의 발현 정도 확인

- E2 및 GnRHa의 복강 주사 후, 뇌하수체에서 GTHα, FSHβ 및 LHβ mRNA의 발현 관찰 / 혈중 17β-estradiol 농도 변화 확인

- rFSH와 rLH의 복강 주사에 의한 GTHα, FSHβ, LHβ mRNA 및 FSHR과 LHR mRNA의 발현 변화 확인

3. 성 전환에 미치는 GnRH 조절기작의 규명

: sGnRH, cGnRH-II 및 sbGnRH의 발현 조절에 관한 연구

- 성 전환 단계별 caspase-3 mRNA 발현 관찰시 성숙한 수컷 및 암컷에 높은 발현 확인

- GnRHa 주입으로 인하여 caspase-3 mRNA 및 활성 증가 / GnRH에 의해 apoptosis 유

도됨을 확인

- 성숙한 정소 및 난소에서 GnRH, GTH 및 각각의 수용체의 발현량의 변화 확인

Purpose&

contents

The objective of the present study is to use an hermaphrodite species (cinnamon clownfish) as experimental models to investigate the mechanisms governing gonadal development and differentiation in response to hormonal factors that influence sex determination and change. The present study will contribute to better understanding of the molecular and cellular basis for hormonal control of sex determination in fish.

Result

1. Reproductive cycle and sexual maturation in cinnamon clownfish

: Certification of the reproductive cycle and gonadal developmental stages

- Investigated the sex-reversal 6 stages, immature male, mature male, male at 60 days after female removal, male at 90 days after female removal, male at 120 days after female removal and mature female, as the results, GTH subunits and GTH receptors mRNA expressions were increased at 90 days

- Investigated the histological observation of gonad by H-E staining, as the result, numbers and size of oocytes were increased at 90 days

- Investigated the plasma E2 concentration, and it was significantly increased at 90 days, this result indicated that E2 plays an important role of sex change, male at 90 days after female removal to female

2. Molecular characterization of sex determinant genes and possibility of sex

change by steroid treatment

: Cloning of the genes related to sex determinant gene

- Cloning of ERb1 (esr2a1), ERb2 (esr2a2), vtg, TRα and TRβ cDNA, and investigation the expression changes of genes during gonad development

- Examined the specific expression of genes related sex-change in developmental stages

- Investigated the expression of genes and proteins through Western blot and hepatocyte culture

- Investigated the expression of GTHα, FSHβ and LHβ mRNA in pituitary after E2 and GnRHa intraperitoneal injection/ changes of plasma 17β-estradiol concentration

- Investigated the expression changes of GTHα, FSHβ, LHβ mRNA, FSHR and LHR mRNA by rFSH and rLH intraperitoneal injection

3. The regulation of apoptosis by GnRH during sex change in cinnamon clownfish

- Examined the high level of caspase-3 mRNA expression in mature male and female during sex-change developmental stages

- Examined that induced the apoptosis by GnRH, through increasing the caspase-3 mRNA expression and activity by GnRHa intraperitoneal injection

- Examined that high level of expression the GnRH, GTH and receptors in mature testis and ovary